SUMO化修饰联合m6A调控？跟着这篇17.4分的Nucleic Acids Research来一起学习吧

N6-腺嘌呤甲基（m6A）是最常见的RNA修饰，广泛存在各种真核生物之中。甲基转移酶样3（METTL3）是m6A修饰的功能蛋白酶，负责调控下游靶基因的表达稳定性。然而针对m6A的研究多以调控下游蛋白的表达为主，目前尚不明确METTL3的上游调控机制。这篇题为《SUMOylation of the m6A-RNA methyltransferase METTL3 modulates its function》的论文从表观遗传学角度揭示了METTL3蛋白修饰与其甲基转移酶活性的重要关系。

（1）证实METTL3的SUMO化修饰

脊椎动物中存在SUMO1、SUMO2、SUMO3三种SUMO基因，是蛋白SUMO化的核心蛋白。首先，作者采用Ni²⁺-NTA树脂沉淀法确定了介导METTL3 SUMO化修饰的SUMO基因。如图1A所示，METTL3可与SUMO1强烈反应，与SUMO2反应程度一般，几乎不与SUMO3相互作用，因此认为SUMO1是METTL3的主要SUMO化位点。接着，鉴于Sentrin/SUMO特异性蛋白酶1（Senp1）是去SUMO1修饰的主要调控因子，作者又进一步确认Senp1与METTL3 SUMO化修饰的关系，结果表明Senp1介导外源性METTL3的去SUMO1化（图1B、1C）。此外作者证明Senp1同样介导内源性METTL3的SUMO化修饰（图1D）。

再而，作者研究了应激对METT3 SUMO化修饰的影响，图1E和1H表明喜树碱、顺铂、阿霉素、足叶、依托泊苷五种药物均可显著诱导METTL3的SUMO化。最后，为验证内源性SUMO1是否介导内源性METTL3的SUMO化修饰，作者还采用免疫共沉淀技术探讨内源性METTL3的SUMO化修饰，如图1F所示，敲降Senp1增强了METTL3的SUMO化修饰，而敲降Ubc9（促进SUMO化的蛋白）则降低了SUMO化的METTL3蛋白水平。同时作者还采用抗SUMO1与METTL3免疫共沉淀，结果同样验证了内源性METTL3上携带SUMO1修饰（图1G）。

图一.METTL3由SUMO1修饰

（2）K177/211/212/215是METTL3的主要SUMO位点

在机制上，SUMO蛋白C端与靶蛋白的赖氨酸残基的游离氨基形成共价键。在本部分，作者将特定赖氨酸（K）位点突变为精氨酸（R），旨在确定METTL3的SUMO化位点。便于后续SUMO化修饰。图2A排除了生信工具预测的7种SUMO化位点（K27、K132、K163、K164、K207、K513、K530），而图2B排除K12/13、K62、K80/81、K122、K327、K345、K388。K177突变和K211/212/215联合突变显著降低METTL3的SUMO化水平（图2C、2D）。然而K211、K212、K215单独突变并不影响METTL3的SUMO化，K177/K211/212/215联合突变（4KR）可干扰METTL3的SUMO化突变（图2D）。图2E证实4KR突变可降低METTL3的SUMO化修饰。因此作者认为K177/K211/212/215是METTL3的主要SUMO化位点。

图二. K177、K211、K212和K215是METTL3中的主要SUMO化位点。

（3）METTL3的SUMO化不影响其稳定性、定位以及与METTL14和WTAP的相互作用

SUMO化修饰对靶蛋白的影响一直是研究人员致力解答的关键问题。作者首先需要确定SUMO化修饰是否影响METTL3蛋白稳定性。MG132是蛋白酶体抑制剂，而氯喹为溶酶体抑制剂，作者分别使用这两种抑制剂处理过表达METTL3的细胞，确定METTL3的蛋白降解途径。图3A表明METTL3主要通过蛋白酶体途径降解。泛素化是蛋白酶体降解的前期基础，作者发现METTL3的SUMO化修饰并不影响该蛋白的泛素化（图3B、3C），因而认为METTL3的SUMO化修饰并不改变METTL3蛋白稳定性。接着，作者又研究了SUMO化修饰对METTL3蛋白核定位的影响。图3D-3F表明，不管METTL3是否发生SUMO化，METTL3都主要分布于细胞核，提示METTL3的SUMO化修饰不影响其核定位。

m6A修饰是最常见的RNA修饰，广泛存在各种真核生物中（m6A修饰的详细介绍可查阅公众号前期文章）。METTL3、METTL14和WTAP是甲基转移酶复合物的主要组成部分，在机制上METTL3可与METTL14相互作用并相互稳定，从而促进METTL14与WTAP相互作用，调节m6A修饰。基于此，作者探讨了METTL3的SUMO化修饰是否改变甲基转移酶之间的相互作用。图3G和3H表明METTL3的SUMO化修饰并不影响METTL3与METTL14或WTAP间的相互作用。最后作者还证实METTL3的SUMO化修饰并不改变其与翻译起始因子（CBP80、eIF4E、elF3B）间的相互作用，揭示METTL3的SUMO化修饰不影响其翻译效率。

图三.METTL3的SUMO化不影响其稳定性、定位或与METTL14和WTAP的相互作用

（4）METTL3的SUMO化抑制其m6A RNA甲基转移酶活性

某些蛋白的SUMO化可能影响其甲基转移活性。作者在本部分揭示了METTL3的甲基转移酶活性与SUMO化之间的深层联系。有意思的是，敲降METTL3引起细胞内m6A水平显著降低（图4A），而敲降Senp1同样导致了类似现象（图4B），提示SUMO化修饰可能通过抑制METTL3活性参与调控m6A水平，图4C显示METTL3过表达显著增加细胞内m6A水平，但这一现象可被SUMO1/Ubc9共转染抵消，表明METTL3的SUMO化修饰可能抑制其甲基转移酶活性。图4D-4F证实由METTL3上4KR突变引起的SUMO化缺失可显著提高细胞内m6A水平。此外作者还基于液相色谱-质谱联用检测不同转染处理后的细胞m6A水平，结果同样验证METTL3上4KR突变对m6A水平的影响（图4G）。作者结合RNA探针技术证实METTL3的SUMO化修饰可显著抑制METTL3的甲基转移酶活性（图4H）。

图4.METTL3的SUMO化修饰抑制其RNA m6A甲基转移酶活性

（5）SUMO化的METTL3抑制m6A修饰促进肿瘤进展的机制研究

METTL3是介导RNA序列m6A修饰的关键蛋白酶，与恶性肿瘤的形成和生长息息相关。在证明METTL3的甲基转移酶活性受SUMO化抑制的基础上，作者又探讨了这一机制是否为肿瘤发生和发展的重要原因。作者选用敲降内源性METTL3的细胞株作为研究对象，向细胞转染METTL3-WT及METTL3-4KR，克隆实验结果表明METTL3-4KR组的菌落数量少于METTL3-WT组菌落数（图5A）。此外异种移植动物模型也证实，相较于METTL3-WT组，METTL3-4KR组的肿瘤平均大小和重量显著减小（图5B），METTL3-WT的SUMO化水平明显高于METTL3-4KR组（图5C）。上述结果表明METTL3的SUMO化修饰促进肿瘤生长。

作者推测METTL3的SUMO位点突变可能导致m6A水平升高，从而抑制肿瘤生长。为了验证这一假设，作者对METTL3-wt组和METTL3-4KR组细胞进行m6A测序（m6A-Seq）和RNA测序（RNA-Seq）分析。MeRIPm6A序列（图6A-6C）表明，相较于METTL3-WT组，METTL3-4KR组m6A水平升高，基因组中3UTR和终止密码子的m6A水平上升最为明显。RNA序列显示，相较于METTL3-WT组，METTL3-4KR组细胞的转录组出现差异表达（图6D）。因此，作者认为SUMO化修饰抑制METTL3的m6A甲基转移酶活性，从而引起下游基因差异表达，促进肿瘤的发生和发展。

图5.METTL3的SUMO化促进H1299细胞的肿瘤发生

图 6.METTL3的SUMO化通过下调m6A水平改变肿瘤基因表达谱

总的来说，这篇文章的思路还是十分清晰。**步，证实METTL3上存在SUMO化，确定METTL3的主要SUMO基因。第二步，挖掘METTL3的SUMO化位点。第三步，从稳定性、相互作用、翻译效率和甲基转移酶活性等方面入手，探讨SUMO化修饰对METTL3蛋白的影响，确定SUMO化修饰抑制METTL3的甲基转移酶活性。第四步，在第三步的基础上进一步解答SUMO化修饰是否通过调节METTL3介导的m6A促进肿瘤的发生和发展，为后续肿瘤研究提供可靠的研究依据。